1.1 Metode Penentuan Kadar Nitrogen
Metode analitik yang paling umum digunakan dalam penentuan kadar nitrogen adalah metode Kjeldahl. Metode tersebut diperkenalkan oleh Johan Kjeldahl pada tahun 1883. Metode ini dapat diterapkan pada senyawa-senyawa organik maupun anorganik meliputi makanan, daging, biji-bijian, air limbah, tanah dan banyak sampel yang lainnya.
Peralatan Keldahl (modern)
1.1.1 Metode Kjeldahl
Metode Kjeldahl merupakan metode yang digunakan untuk menentukan kadar nitrogen dalam senyawa organik maupun senyawa anorganik. Metode ini telah mengalami perubahan secara teknis dan pada peralatannya selama lebih dari 100 tahun sejak diperkenalkan, namun secara mendasar, prinsip yang digunakan tetaplah sama. Metode Kjeldahl dapat dibagi menjadi tiga tahap utama, yakni:
1. Digesi (Digestion)
Tahap digesi merupakan tahap dekomposisi nitrogen dalam sampel menggunakan asam pekat. Tahap ini disempurnakan dengan mendidihkan sampel pada asam sulfat pekat. Hasil akhir digesi merupakan larutan amonium sulfat.
2. Distilasi (Distillation)
Merupakan tahap penambahan basa berlebih ke dalam larutan digesi untuk mengubah NH4+ menjadi NH3 yang diikuti pemanasan dan kondensasi gas NH3 pada larutan penerima.
3. Titrasi (Titration)
Tahap ini bertujuan untuk mengetahui jumlah amoniak dalam larutan penerima. Jumlah nitrogen dapat dihitung dari jumlah ion amonia di dalam larutan penerima tersebut.
Beberapa kondisi tersebut dapat dijelaskan sebagai berikut:
1.1.2 Tahap Digesi
Persamaan umum untuk proses digesi ditunjukkan melalui persamaan 3.1 di bawah ini
N organik/anorganik + H2SO4 à (NH4)2SO4 + H2O + CO2 + hasil samping (3.1)
Sejumlah kondisi internal digesi sangat menentukan laju reaksi dan kesempurnaan pemecahan nitrogen menjadi amonium sulfat. Beberapa diantara kondisi tersebut antara lain adalah pemanasan yang diberikan pada campuran digesi, penambahan sejumlah garam untuk meningkatkan titik didih asam, laju refluks asam sulfat pada leher labu digesi, lama digesi dan penambahan katalis. Pengaturan salah satu kondisi tersebut akan sangat berpengaruh pada kondisi yang lain. Kondisi digesi yang baik diperoleh dengan menyeimbangkan faktor-faktor tersebut dalam suatu pola yang terkontrol dan berulang. Jika suatu sampel mengandung nitrogen nitrat atau nitrit, maka perlu dilakukan perlakuan awal secara kimiawi untuk ikut memasukkan atau mengeluarkan sumber nitrogen pada analisa yang dilakukan.
a. Pertimbangan Asam
Asam sulfat telah lama digunakan untuk proses digesi sampel. Jumlah asam yang digunakan dipengaruhi oleh ukuran dan jumlah sampel yang juga menunjukkan jumlah nitrogen. Sampel yang banyak tentu membutuhkan jumlah asam yang lebih banyak pula. Selain itu, lama pemanasan dan suhu yang diberikan juga berpengaruh terhadap jumlah asam yang hilang akibat penguapan.
b. Suhu Pemanasan dan Lama Digesi
Unsur pemanasan yang digunakan pada digesi Kjeldahl meliputi beberapa variasi pengaturan. Suhu pemanasan yang digunakan umumnya berpatokan pada suhu yang dapat menyebabkan “250 ml air yang suhunya 25 °C dapat mendidih dalam waktu lima menit”.
Sampel organik umumnya menjadi hitam dan berarang selama proses digesi ini. Reaksinya dapat berjalan hebat pada permulaan tergantung pada matriks dan suhu pemanasan. Namun lama kelamaan campuran digesi menjadi jernih karena terjadinya pembentukan CO2 akibat dekomposisi organik. Keberadaan ion logam dapat memberikan warna pada campuran digesi. Hal yang perlu diperhatikan adalah jernihnya larutan tidak menunjukkan semua nitrogen organik telah terpecah.
1.1.3 Proses Distilasi
Campuran digesi selanjutnya diencerkan dan dibasakan melalui penambahan NaOH. Proses distilasi ini menghasilkan NH3 menurut persamaan 3.2 :
(NH4)2SO4 + 2NaOH à 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O (3.2)
Labu Kjeldahl ditempatkan pada kondensor air dan dipanaskan untuk menguapkan gas NH3 dari larutan. Ujung kondensor yang dihubungkan dengan labu yang berisi larutan penerima yang berupa asam, baik berupa asam standar maupun asam borat. Parlakuan ini dilakukan untuk menangkap NH3 yang teruapkan.
a. Pengenceran Larutan Digesi
Campuran asam digesi biasanya didinginkan dan diencerkan dengan air yang bebas amonia. Pengenceran campuran digesi juga bertujuan untuk mencegah terjadinya ledakan selama proses distilasi. Pencegahan ledakan juga bisa dilakukan dengan menambahkan batu didih pada larutan digesi, sementara itu penambahan dua atau tiga tetes tributil sitrat bisa dilakukan untuk mencegah terjadinya busa.
b. Penambahan NaOH
NaOH pekat (biasanya larutan NaOH 50%) ditambahkan secara perlahan ke dalam larutan yang akan didistilasi. Umumnya, untuk tiap 5 ml asam sulfat pekat larutan digesi, dibutuhkan 20 ml NaOH 50% untuk membuat larutan menjadi bersifat basa kuat. Labu dihubungkan dengan kondensor sebelum proses pemanasan dan distilasi dilakukan. Untuk sampel yang tidak memerlukan proses digesi seperti penentuan amoniak secara langsung dalam air, sampel disangga pada pH 9,5 dengan larutan natrium tetraborat dan natrium hidroksida untuk mengurangi hidrolisis senyawa kompleks nitrogen organik yang ada.
c. Distilasi
Sebagian besar NH3 didistilasi dan terperangkap ke dalam larutan asam penangkap selama 5 sampai 10 menit awal pemanasan. Tetapi, tergantung pada volume campuran digesi dan metode yang digunakan, 15 sampai 150 ml kondensat dapat dikumpulkan dalam labu penerima untuk memastikan didapatnya kembali nitrogen. Perpanjangan waktu distilasi dan volume yang dikumpulkan menghasilkan lebih banyak air yang juga akan tertampung pada larutan penerima. Namun kelebihan air ini tidak akan memperngaruhi hasil titrasi. Waktu distilasi dan volume distilat yang dikumpulkan harus distandarisasi. Laju distilasi dipengaruhi oleh kapasitas pendinginan dari kondensor dan suhu air pendingin.
Peralatan prakondisi diperlukan katika sampel yang akan ditentukan kadar nitrogennya memiliki kadar nitrogen yang sangat kecil sebelum sampel tersebut didistilasi. Hal ini dapat dilakukan dengan mendistilasi campuran air bebas amonia dan NaOH 50% denganperbandingan 1:1 selama 5 menit sebelum sampel didistilasi untuk mengurangi kontaminasi dari amonia di atmosfer.
d. Larutan Penerima
Larutan yang digunakan sebagai larutan untuk menangkap amonia merupakan asam yang bisa berupa asam standar ataupun asam borat. Jika yang digunakan sebagai larutan penerima adalah HCl atau H2SO4, maka akan lebih baik jika hanya ada sedikit kelebihan asam yang tertinggal setelah NH3 didistilasi dan terperangkap untuk menghindari titrasi balik. Dengan mengantisipasi jumlah nitrogen dalam sampel. Jumlah target asam standar dapat dihitung menurut persamaan 3.3 :
Konsentrasi yang tepat tidak terlalu dibutuhkan jika larutan penerima yang digunakan adalah asam borat. Hal ini karena proses titrasi langsung menghitung jumlah amonia dalam larutan distilat dengan menetralkan kompleks yang terbentuk antara amonia dan asam borat (perbandingan 1:1). Jumlah asam borat yang banyak bisa ditambahkan pada larutan penerima sehingga absorpsi amonia dapat berlangsung dengan sempurna.
Volume larutan penerima dapat ditingkatkan dengan menambahkan air bebas amonia sehingga ujung pipa pengantar bisa tercelup ke larutan tersebut. Pipa pegantar harus selalu dibilas ke dalam labu penerima sesaat sebelum labu tersebut dipindahkan dari perangkat distilasi. Larutan penerima harus berada pada suhu 45 C selama proses distilasi untuk mencegah hilangnya amonia.
1.1.4 Proses Titrasi
Terdapat dua macam titrasi yang digunakan pada proses Kjeldahl, yakni titrasi balik yang biasanya digunakan pada Kjeldahl Makro dan titrasi langsung. Kedua metode tersebut mengindikasikan keberadaan amonia dalam air distilat dengan menunjukkan perubahan warna dan memungkinkan dilakukannya perhitungan konsentrasi.
a. Penentuan Nitrogen Melalui Titrasi Balik
Pada titrasi balik, amonia ditangkap dengan larutan asam yang telah distandarisasi dengan sangat tepat pada labu penerima. Kelebihan asam pada larutan penerima menjaga pHnya tetap rendah sehingga indikator tidak berubah warna.
2NH3 + 2H2SO4 à (NH4)2SO4 + H2SO4 (3.4)
Kelebihan larutan asam kemudian dinetralkan dengan larutan basa yang telah distandarisasi dengan tepat misalnya basa NaOH. Perubahan warna terjadi ketika titrasi mencapai titik akhirnya.
(NH4)2SO4 + H2SO4 + 2NaOH à (Na)2SO4 + (NH4)2SO4 + 2H2O (3.5)
b. Penentuan Nitrogen Melalui Titrasi Langsung
Titrasi langsung dilakukan dengan menggunakan asam borat sebagai larutan penerimanya. Reaksi yang terjadi pada titrasi ini adalah:
NH3 + H3BO3 à NH4+:H2BO3- + H3BO3 (3.6)
Asam borat menangkap gas amonia dan membentuk kompleks borat. Setelah amonia terkumpulkan, maka warna larutan penerima akan berubah.
2NH4H2BO3- + H2SO4 à NH4+:H2BO3- + H3BO3 (3.7)
Penambahan asam sulfat menetralkan kompleks amonium borat sehingga perubahan warna terjadi.
Metode asam borat ini memiliki dua kelebihan yakni hanya membutuhkan satu larutan standar untuk proses penentuan kadar nitrogen dan larutan memiliki waktu hidup yang lama.
a. Indikator
Beberapa indikator yang berbeda telah digunakan untuk dapat memberikan perbedaan warna yang mencolok selama proses titrasi. Analis biasanya menggunakan indikator yang spesifik dan hal ini sangat terganting pada pilihan personal. Namun demikian, indikator yang sering digunakan adalah campuran dari metil merah dan metilen biru. Indikator harus memiliki trayek pH perubahan wrana dimana titik ekivalen titrasi terjadi.
b. Perhitungan
Perhitungan kadar nitrogen harus disesuaikan dengan larutan penerima yang digunakan dan faktor pengenceran selama proses distilasi. Pada persamaan di bawah, “N” menunjukkan normalitas. “ml blank‘ adalah mililiter yang diperlukan untuk titrasi balik reagen blank jika yang digunakan adalah asam standar, atau menunjukkan mililiter asam standar yang dibutuhkan untuk mentitrasi larutan penerima. Ketika asam standar digunakan sebagai larutan penerima, persamaan yang digunakan adalah
Jika berat sampel berupa miligram, berat molekul nitrogen harus diubah menjadi 1400,67.
Ketika asam borat digunakan sebagai larutan penerima, maka persamaan yang digunakan adalah:
